Es el método de análisis
óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es
un instrumento que permite comparar la radiación absorbida
o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una
que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Principio de la
Espectrofotometría
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante,
aun el vidrio que parece ser completamente
transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al
espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la
región del infrarrojo.
La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles
e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica
para cada sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una
sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede
producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe
a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide
sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no
absorbidas.
La espectrofotometría ultravioleta-visible
usa haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 80 a
400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800
nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región
ultravioleta y visible del espectro.
Al campo de luz uv de 200 a 400 nm
se le conoce también como rango de uv cercano , la espectrofotometría visible
solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible , de 400 a
800 nm.
Además, no está de menos mencionar
el hecho de que la absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad
de la concentración y de la distancia recorrida.
La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por
un cuerpo depende de la concentración en la solución.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio
tenemos agua con azúcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad
de agua pero con más azúcar diluida. El vaso es una celda fotoeléctrica, y la
solución de azúcar es la que se mide su concentración.
Según la ley de Beer, si
hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que
saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya
que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan
contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.
En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por
un objeto depende de la distancia recorrida por la luz.
Por ejemplo, retomando el ejemplo
de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y
la misma concentración de azúcar, pero, el segundo tiene un diámetro mayor que
el otro.
Según la ley de Lambert, si
hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que
saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya
que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan
contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos; de la misma forma
que se explicó en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la ley
de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinación
de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorción de las radiaciones
Al hacer pasar una cantidad de
fotones o de radiaciones, por las leyes mencionadas anteriormente, hay una
pérdida que se expresa con la ecuación:
It/Io=T-kdc''
Donde It ,
es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda
fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); y Io que
es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación
intensidad incidente) y la relación entre ambas (T) es la
transmitancia.
En el exponente, el signo negativo
se debe a que la energía radiente decrece a medida que el recorrido aumenta.
Donde k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo
electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que
recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya
ubicada en la cubeta.
La ecuación simplificada de
la ley de Beer-Lambert
A = ε.d.c
Comprende a la mínima ecuación
que relaciona la concentración (c), la absorbencia de la muestra (A), el
espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración
relaciona la concentración y la absorbencia de los estándares.
La absorción (o absorbencia) es
igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la transmitancia:
A= log 1/T
Lo que es igual a:
A= -log T
Las aplicaciones
principales son:
§ Determinar
la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas
ya mencionadas.
§ Para la
determinación de estructuras moleculares.
§ La
identificación de unidades estructurales especificas ya que estas tienen
distintos tipos de absorbencia (grupos funcionales o isomerías).
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que
sirve para medir, en función de la longitud de onda, la
relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces
de radiaciones. También
es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de
sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de
espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa.
Este instrumento tiene la
capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y
medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al
operador realizar dos funciones:
1. Dar información sobre la naturaleza de la
sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente que
cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra.
Fuente de luz
La misma ilumina la muestra. Debe
cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionabilidad, distribución de
energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara
de wolframio(también
llamado tungsteno), lámpara
de arco de xenón.kl y lampara de Deuterio que es
utilizada en los laboratorios atómicos.
Monocromador
El monocromador aísla las
radiaciones de longitud de onda deseada
que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz
monocromática. Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de
dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida Es un lente
que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un
prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud
deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de
salida.
Compartimiento de Muestra
Es donde tiene lugar la
interacción, R.E.M con la materia (debe producirse donde no haya absorción ni dispersión
de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso,
se aplica la ley de lambert-beer en su máxima expresión, en base a sus leyes de
absorción, y lo implica esto, en lo que concierne al paso de la molécula de
fundamental-excitado.
Detector
El detector, es quien detecta una
radiación y a su vez lo deja en evidencia, para posterior estudio. Hay de dos
tipos: a) los que responden a fotones; y b) los que responden al calor
Registrador
Convierte el fenómeno físico, en
números proporcionales al analito en cuestión.
Foto detectores
En los instrumentos modernos se
encuentra una serie de 16 fotos detectores para percibir la señal en forma
simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce
el tiempo de medida, y minimiza las partes móviles del equipo.
